核酸的分子生物学检测方法,如聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR),能够用于精准地分析样本中微生物的种类和丰度,但是难以区分微生物的存活状态。传统的用于检测样本中活细胞的方法都需要对样本进行培养,但是此类检测方法存在一定的局限性,无法用于检测一些难培养或是不可培养的活细胞。
叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide,PMA)是一种能与DNA结合的光反应染料,不具有细胞膜渗透性,无法穿透活细胞完整的细胞膜,只能选择性地穿透死细胞受损的细胞膜。进入细胞后,PMA会与DNA双螺旋发生共价交联,进而阻碍死细胞中目标DNA的PCR扩增,如图所示。
基于PMA的这一特性,通过对PMA处理过的样本进行PCR扩增和测序分析,即可得知样本中微生物的存活状态。
qPCR 法选择性的检测活细菌和死细菌,可广泛用于食品安全检测PMA高效选择和灵敏的检测死细菌中存在的活菌数在许多实际应用,包括安全检查,食品,饮用水的质量控制,医疗诊断等方面至关重要。传统使用细菌培养的检测方法,既费时又不灵敏。建立在实时荧光定量qPCR上的检测,是一个快速而高度敏感的替代方法。然而普通qPCR方法的分析结果并不能区分活死细胞。
定量 PCR 基本操作步骤
qPCR 法选择性的检测活细菌和死细菌,可广泛用于食品安全检测
添加 PMA 染料到样品中,并在黑暗中孵育
• 暴露在冷光下,使 PMA 染料交联到 DNA 上
• 裂解完整的细胞,提取 DNA
• 常规实时荧光定量 PCR PMA 高效选择和灵敏的检测死细菌中存在的活菌数在许多实际应用,包括安全检查,食品,饮用水的质量控制,医疗诊断等方面至关重要。
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